甲鱼蛋粉对小鼠淋巴细胞增殖和NK细胞活性的影响
【摘要】 目的 探讨甲鱼蛋粉(TE)及甲鱼蛋粉与无味蒜粉、维生素E、红花籽油的混合物(TEM)对小鼠脾淋巴细胞增殖能力及NK细胞活性的影响。方法 以小鼠为动物模型，设立对照组、TE组(1.125g/kg)及TEM组(0.75、2.25、7.5g/kg)，TE组和TEM组连续30天经口灌胃给予TE及TEM，分别测定免疫器官相对重量、ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力以及NK细胞活性。结果 小鼠经口给予TE和TEM30天后，与正常对照组比较，TE组小鼠脾脏相对重量、ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力及NK细胞活性均明显增加;TEM低剂量组小鼠脾脏相对重量明显增加，高剂量组小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力及NK细胞活性明显增加。结论单独的甲鱼蛋粉以及甲鱼蛋粉与蒜粉、维生素E、红花籽油的混合物均具有免疫增强作用，而且甲鱼蛋粉与大蒜粉、维生素E和红花籽油之间可能存在协同作用。
关键词 甲鱼蛋粉 维生素E 红花籽油 大蒜粉 免疫功能
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)10-1448-03
, 百拇医药
Effect of turtle egg powder mixture on lymphocyte
proliferation and NK cell activity in mice
Wang Junbo，Yu Huanling，Shen Xiaoyi，et al.
School of Public Health，Peking University，Beijing100083.
【Abstract】 Objective To explore the effects of turtle egg powder(TE)and turtle egg powder mixture(TEM)(comprised of TE，garlic powder，vitamin E and safflower oil)on immune function.Methods 50female KM mice were randomly divided into TE(1.125g/kg)，TEM1(0.75g/kg)，TEM2(2.25g/kg)，TEM3(7.5g/kg)and negative control groups respectively.After the mice were oral administered TE andTEM for30days，spleen and thymus were weighted，the ConA induced spleen lymphocyte proliferation capacity was determined by MTT method and the NK cell activity
, 百拇医药
was assayed by LDH method.Results Compared with negative control group，the spleen weight/body weight ratio increased significantly in TE and TEM1group，and the capacity of spleen lymphocyte proliferation induced by ConA，and the NK cell activity enhanced obviously in TE group and the TEM3group.Conclusion Our study su
ggestˉed that both TE and TEM could improve the immune function in mice，moreover TEM excelled TE in immune enhanceˉment which indicates that there may be some interaction between TE and garlic powder，vitamin E and safflower oil.Key words turtle egg powder vitamin E safflower oil garlic powder immune function
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甲鱼(turtle)滋阴强身的功效在中国古代医书中早有记载，《随息居饮食谱》记载“滋肝肾之阴，清虚劳之热”。近年来，研究表明甲鱼富含多种营养素，具有增强免疫、抑制肿瘤、抗氧化损伤和延缓衰老等作用。甲鱼蛋又称鳖卵，《本草纲目》和《本草蒙筌》中均有记载“鳖卵主治小儿下痢”、“盐腌煮吞，补阴虚亦验”。甲鱼蛋是一种营养价值很高的天然食物，随着人们对甲鱼营养价值认识的逐渐提高，甲鱼养殖业迅猛发展，甲鱼蛋资源日益丰富。但迄今为止，关于甲鱼蛋的营养价值和保健作用及其作用机制的研究尚未开展，甲鱼蛋保健食品的合理开发和利用也十分罕见。本研究以小鼠为模型，观察了甲鱼蛋粉制剂对小鼠脾淋巴细胞增殖和NK细胞活性的影响，以探讨甲鱼蛋粉制剂对免疫功能的调节作用，为进一步开展甲鱼蛋的保健作用及其合理开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 甲鱼蛋粉(TE)及甲鱼蛋粉混合物(TEM)均由 日本乐模公司提供，甲鱼蛋粉混合物由甲鱼蛋粉、维生素E、无味蒜粉及红花籽油组成，其中含甲鱼蛋粉15%。甲鱼蛋粉及其混合物的营养成分分析由日本食品研究实验室进行测定分析(表1)。
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1.2 动物 昆明种健康雌性小鼠(二级):6～8周龄，18～22g。由北京大学医学部实验动物中心提供，合格证号SCXK11-00-0004。
1.3 仪器和试剂 Bio-Rad酶标仪(美国)，SANYO二氧化碳培养箱(日本)，ConA、MTT、琼脂糖、SDS为Sigma产品;胎牛血清、RPMI1640培养液为Hyclone产品;YAC-1细胞由北京大学免疫学系提供，其余试剂均为分析纯。
1.4 剂量分组及给药方法 昆明雌性小鼠50只，按体重随机分成5组，即溶剂对照组(3%淀粉溶液)、TE组(1.125g/kg)、TEM1组(0.75g/kg)、TEM2组(2.25g/kg)和TEM3组(7.5g/kg)。其中TE组中甲鱼蛋粉的给药量与TEM3组中相同。TE、TEM均以3%淀粉溶液配制成混悬液，以灌胃方式给予，灌胃量按0.3ml/10g体重计算，每日1次，每周称量体重调整灌胃量，连续灌胃30天，实验期间动物自由进食、饮水。
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表1 甲鱼蛋粉制剂、甲鱼蛋粉以及甲鱼的主要营养成分比较 (略)
1.5 检测指标及方法
1.5.1 体重及免疫器官相对重量 实验期内每周称体重，实验结束时颈椎脱臼处死动物，无菌取脾脏和胸腺，称重并计算相对重量。
1.5.2 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力 无菌取脾，磨碎，过滤(200目)，洗涤，悬浮，制备成细胞浓度为5×10 6 脾细胞悬液。将上述脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，实验孔加75μl ConA，另一孔不加ConA，作为 对照孔。置5%CO 2 、37℃CO 2 培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸弃上清液0.7ml，加入0.7ml不含胎牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT50μl，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml3%SDS，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，于570nm波长处测定OD值，以实验孔与对照孔OD值的差值代表淋巴细胞增殖能力。
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1.5.3 NK细胞活性测定 无菌取脾，磨碎，过滤(200目)，洗涤，裂解红细胞，悬浮，制备成细胞浓度为2×10 7 /ml脾细胞悬液，即效应细胞。取经传代培养的细胞浓度为4×105 /ml的靶细胞(YAC-1细胞)和上述效应细胞各100μl(效靶比50∶1)，加入96孔培养板中，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞、1%NP40和2.5%Triton各100μl。置37℃、5%CO 2 培养箱中培养4h，离心，每孔吸取上清液100μl置另一96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应5min，每孔加入1mol/L的HCl30μl，于酶标仪490nm波长处测定OD值，按下列公式计算
NK细胞活性:NK细胞活性(%)= 样品孔OD-自然释放孔OD/最大释放孔OD-自然释放孔OD ×100%
1.6 统计学方法 所有数据以均数±标准差表示，采用SPSS10.0软件进行单因素方差分析，比较各实验组与对照组的差异。
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2 结果
2.1 TE及TEM对小鼠体重及免疫器官相对重量的影响 TE及TEM各组体重与正常对照组比较差异无显著性(P>0.05)。TE及TEM各组胸腺及脾脏相对重量均高于对照组。其中TE组和0.75g/kg TEM组脾脏相对重量与对照组相比差异有显著性(P<0.05)，提示TE及TEM可能增加免疫器官的相对重量(表2，3)。
表2 TE及TEM对小鼠体重的影响 (略)
表3 TE及TEM对小鼠免疫器官相对重量的影响 (略)
2.2 TE及TEM对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 与正常对照组比较，TE及TEM各组小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力均有不同程度的增高，其中TE组和7.5g/kg TEM组增殖能力明显高于正常对照组(P<0.05)，增高幅度均达到39%，而且在不同剂量的TEM组之间存在剂量反应关系，经线性趋势检验显著。这表明TE及TEM具有促进ConA诱导的淋巴细胞增殖的作用，而且单独TE组与7.5g/kg TEM组作用强度相同，见表4。
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2.3 TE及TEM对小鼠NK细胞活性的影响 TE及TEM3 组小鼠NK细胞活性明显高于正常对照组，差异具有显著性(P<0.01)。与对照组相比，TEM3组小鼠NK细胞活性增高达123%，而TE组小鼠NK细胞活性增高幅度为66%(表4)。
表4 TE及TEM对ConA诱导的脾淋巴细胞增殖和NK细胞活性的影响 (略)
3 讨论
甲鱼是一种营养丰富的天然食品，近年来大量研究结果提示，甲鱼具有增强免疫、抑制肿瘤、抗氧化损伤和延缓衰老等作用 [2～4] 。而甲鱼蛋作为中国传统的名贵药材之一，其功效早在《本草纲目》中便有记载，但关于其营养价值及保健作用的研究在国内外均未见报道。本研究通过对甲鱼蛋的营养成分与甲鱼进行比较，由于缺乏甲鱼干粉的营养成分数据，按照甲鱼中水分含量80%来推算，甲鱼蛋粉中多数营养成分的含量与甲鱼相当，且其氨基酸和脂肪酸组成也与甲鱼 [5] 类似，而钙含量远高于甲鱼。据此推测甲鱼蛋粉应具有类似于甲鱼的营养保健作用。
, 百拇医药
大蒜作为常用的药食两用植物，其对免疫系统功能的有益作用也得到了研究证实 [6]。维生素E是人体必需维生素之一，在体内具有多种生理功能，作为体内重要的抗氧化剂，在维持细胞正常生理功能方面发挥重要作用，适量补充维生素E能增强抗体和补体的产生以及抗体对抗原的应答反应，促进淋巴细胞的增殖、分化和细胞因子的产生，提高免疫细胞的细胞毒作用和吞噬细胞的吞噬作用 [7] 。红 花籽油系由传统中药红花的种籽提炼而来，富含不饱和脂肪酸，其中亚油酸的含量高达85%，虽然目前尚无有关红花籽油对免疫功能的影响资料，但红花对免疫功能具有促进作用已经得到研究证实，《本草纲目》中记载“红花籽功能与花同” [8] 。
本研究在国内首次对甲鱼蛋的保健作用进行了探讨。结果表明，甲鱼蛋粉及其混合物均可提高小鼠脾脏的相对重量和NK细胞活性，并可促进ConA诱导的脾淋巴细胞增殖;而且甲鱼蛋粉混合物对NK细胞活性的增强作用优于单独的甲鱼蛋粉，提示甲鱼蛋粉与大蒜、维生素E、红花籽油之间可能存在联合作用，但其具体的作用模式尚不能确定。本研究的结果对于进一步研究甲鱼蛋的保健作用和合理开发天然甲鱼蛋保健产品具有重要的指导意义。
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参考文献
1 中国疾病控制中心营养与食品安全所.中国食物成分表2002.北京:北京大学医学出版社，2002.
2 向荣，项宇菲，秦慧莲，等.甲鱼多糖制剂的抗肿瘤作用和对免疫功能影响的初步实验研究.上海免疫学杂志，1994，144):206-208.
3 刘小立，孙秀发.甲鱼提取液抗肿瘤作用的研究.食品科学，1997，18(9):64-66.
4 郑艺青，孙秀发.甲鱼提取液延缓衰老和提高免疫功能作用的研究.食品科学，1997，18(8):41-43.
5 钱国英，朱秋华.不同生长条件对中华鳖营养成分的影响.营养学报，2001，23(2):181-183.
6 叶海英，张忠义，徐峰.大蒜免疫调节作用的研究进展.中医药学报，2003，31(3):54-56.
7 周显青，孙儒泳，牛翠娟.维生素E对免疫功能的影响.生理科学进展，2000，31(2):163-165.
8 凌学静，张海石，黄岩.西红花对小鼠免疫增强作用的研究.中国中医基础医学杂志，1998，4(12):28-29.
作者单位:1 100083北京大学公共卫生学院
2 日本乐模公司
(编辑秋 实), 百拇医药(王军波)
关键词 甲鱼蛋粉 维生素E 红花籽油 大蒜粉 免疫功能
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)10-1448-03
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Effect of turtle egg powder mixture on lymphocyte
proliferation and NK cell activity in mice
Wang Junbo，Yu Huanling，Shen Xiaoyi，et al.
School of Public Health，Peking University，Beijing100083.
【Abstract】 Objective To explore the effects of turtle egg powder(TE)and turtle egg powder mixture(TEM)(comprised of TE，garlic powder，vitamin E and safflower oil)on immune function.Methods 50female KM mice were randomly divided into TE(1.125g/kg)，TEM1(0.75g/kg)，TEM2(2.25g/kg)，TEM3(7.5g/kg)and negative control groups respectively.After the mice were oral administered TE andTEM for30days，spleen and thymus were weighted，the ConA induced spleen lymphocyte proliferation capacity was determined by MTT method and the NK cell activity
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was assayed by LDH method.Results Compared with negative control group，the spleen weight/body weight ratio increased significantly in TE and TEM1group，and the capacity of spleen lymphocyte proliferation induced by ConA，and the NK cell activity enhanced obviously in TE group and the TEM3group.Conclusion Our study su
ggestˉed that both TE and TEM could improve the immune function in mice，moreover TEM excelled TE in immune enhanceˉment which indicates that there may be some interaction between TE and garlic powder，vitamin E and safflower oil.Key words turtle egg powder vitamin E safflower oil garlic powder immune function
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甲鱼(turtle)滋阴强身的功效在中国古代医书中早有记载，《随息居饮食谱》记载“滋肝肾之阴，清虚劳之热”。近年来，研究表明甲鱼富含多种营养素，具有增强免疫、抑制肿瘤、抗氧化损伤和延缓衰老等作用。甲鱼蛋又称鳖卵，《本草纲目》和《本草蒙筌》中均有记载“鳖卵主治小儿下痢”、“盐腌煮吞，补阴虚亦验”。甲鱼蛋是一种营养价值很高的天然食物，随着人们对甲鱼营养价值认识的逐渐提高，甲鱼养殖业迅猛发展，甲鱼蛋资源日益丰富。但迄今为止，关于甲鱼蛋的营养价值和保健作用及其作用机制的研究尚未开展，甲鱼蛋保健食品的合理开发和利用也十分罕见。本研究以小鼠为模型，观察了甲鱼蛋粉制剂对小鼠脾淋巴细胞增殖和NK细胞活性的影响，以探讨甲鱼蛋粉制剂对免疫功能的调节作用，为进一步开展甲鱼蛋的保健作用及其合理开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 甲鱼蛋粉(TE)及甲鱼蛋粉混合物(TEM)均由 日本乐模公司提供，甲鱼蛋粉混合物由甲鱼蛋粉、维生素E、无味蒜粉及红花籽油组成，其中含甲鱼蛋粉15%。甲鱼蛋粉及其混合物的营养成分分析由日本食品研究实验室进行测定分析(表1)。
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1.2 动物 昆明种健康雌性小鼠(二级):6～8周龄，18～22g。由北京大学医学部实验动物中心提供，合格证号SCXK11-00-0004。
1.3 仪器和试剂 Bio-Rad酶标仪(美国)，SANYO二氧化碳培养箱(日本)，ConA、MTT、琼脂糖、SDS为Sigma产品;胎牛血清、RPMI1640培养液为Hyclone产品;YAC-1细胞由北京大学免疫学系提供，其余试剂均为分析纯。
1.4 剂量分组及给药方法 昆明雌性小鼠50只，按体重随机分成5组，即溶剂对照组(3%淀粉溶液)、TE组(1.125g/kg)、TEM1组(0.75g/kg)、TEM2组(2.25g/kg)和TEM3组(7.5g/kg)。其中TE组中甲鱼蛋粉的给药量与TEM3组中相同。TE、TEM均以3%淀粉溶液配制成混悬液，以灌胃方式给予，灌胃量按0.3ml/10g体重计算，每日1次，每周称量体重调整灌胃量，连续灌胃30天，实验期间动物自由进食、饮水。
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表1 甲鱼蛋粉制剂、甲鱼蛋粉以及甲鱼的主要营养成分比较 (略)
1.5 检测指标及方法
1.5.1 体重及免疫器官相对重量 实验期内每周称体重，实验结束时颈椎脱臼处死动物，无菌取脾脏和胸腺，称重并计算相对重量。
1.5.2 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力 无菌取脾，磨碎，过滤(200目)，洗涤，悬浮，制备成细胞浓度为5×10 6 脾细胞悬液。将上述脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，实验孔加75μl ConA，另一孔不加ConA，作为 对照孔。置5%CO 2 、37℃CO 2 培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸弃上清液0.7ml，加入0.7ml不含胎牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT50μl，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml3%SDS，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，于570nm波长处测定OD值，以实验孔与对照孔OD值的差值代表淋巴细胞增殖能力。
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1.5.3 NK细胞活性测定 无菌取脾，磨碎，过滤(200目)，洗涤，裂解红细胞，悬浮，制备成细胞浓度为2×10 7 /ml脾细胞悬液，即效应细胞。取经传代培养的细胞浓度为4×105 /ml的靶细胞(YAC-1细胞)和上述效应细胞各100μl(效靶比50∶1)，加入96孔培养板中，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞、1%NP40和2.5%Triton各100μl。置37℃、5%CO 2 培养箱中培养4h，离心，每孔吸取上清液100μl置另一96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，反应5min，每孔加入1mol/L的HCl30μl，于酶标仪490nm波长处测定OD值，按下列公式计算
NK细胞活性:NK细胞活性(%)= 样品孔OD-自然释放孔OD/最大释放孔OD-自然释放孔OD ×100%
1.6 统计学方法 所有数据以均数±标准差表示，采用SPSS10.0软件进行单因素方差分析，比较各实验组与对照组的差异。
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2 结果
2.1 TE及TEM对小鼠体重及免疫器官相对重量的影响 TE及TEM各组体重与正常对照组比较差异无显著性(P>0.05)。TE及TEM各组胸腺及脾脏相对重量均高于对照组。其中TE组和0.75g/kg TEM组脾脏相对重量与对照组相比差异有显著性(P<0.05)，提示TE及TEM可能增加免疫器官的相对重量(表2，3)。
表2 TE及TEM对小鼠体重的影响 (略)
表3 TE及TEM对小鼠免疫器官相对重量的影响 (略)
2.2 TE及TEM对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 与正常对照组比较，TE及TEM各组小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力均有不同程度的增高，其中TE组和7.5g/kg TEM组增殖能力明显高于正常对照组(P<0.05)，增高幅度均达到39%，而且在不同剂量的TEM组之间存在剂量反应关系，经线性趋势检验显著。这表明TE及TEM具有促进ConA诱导的淋巴细胞增殖的作用，而且单独TE组与7.5g/kg TEM组作用强度相同，见表4。
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2.3 TE及TEM对小鼠NK细胞活性的影响 TE及TEM3 组小鼠NK细胞活性明显高于正常对照组，差异具有显著性(P<0.01)。与对照组相比，TEM3组小鼠NK细胞活性增高达123%，而TE组小鼠NK细胞活性增高幅度为66%(表4)。
表4 TE及TEM对ConA诱导的脾淋巴细胞增殖和NK细胞活性的影响 (略)
3 讨论
甲鱼是一种营养丰富的天然食品，近年来大量研究结果提示，甲鱼具有增强免疫、抑制肿瘤、抗氧化损伤和延缓衰老等作用 [2～4] 。而甲鱼蛋作为中国传统的名贵药材之一，其功效早在《本草纲目》中便有记载，但关于其营养价值及保健作用的研究在国内外均未见报道。本研究通过对甲鱼蛋的营养成分与甲鱼进行比较，由于缺乏甲鱼干粉的营养成分数据，按照甲鱼中水分含量80%来推算，甲鱼蛋粉中多数营养成分的含量与甲鱼相当，且其氨基酸和脂肪酸组成也与甲鱼 [5] 类似，而钙含量远高于甲鱼。据此推测甲鱼蛋粉应具有类似于甲鱼的营养保健作用。
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大蒜作为常用的药食两用植物，其对免疫系统功能的有益作用也得到了研究证实 [6]。维生素E是人体必需维生素之一，在体内具有多种生理功能，作为体内重要的抗氧化剂，在维持细胞正常生理功能方面发挥重要作用，适量补充维生素E能增强抗体和补体的产生以及抗体对抗原的应答反应，促进淋巴细胞的增殖、分化和细胞因子的产生，提高免疫细胞的细胞毒作用和吞噬细胞的吞噬作用 [7] 。红 花籽油系由传统中药红花的种籽提炼而来，富含不饱和脂肪酸，其中亚油酸的含量高达85%，虽然目前尚无有关红花籽油对免疫功能的影响资料，但红花对免疫功能具有促进作用已经得到研究证实，《本草纲目》中记载“红花籽功能与花同” [8] 。
本研究在国内首次对甲鱼蛋的保健作用进行了探讨。结果表明，甲鱼蛋粉及其混合物均可提高小鼠脾脏的相对重量和NK细胞活性，并可促进ConA诱导的脾淋巴细胞增殖;而且甲鱼蛋粉混合物对NK细胞活性的增强作用优于单独的甲鱼蛋粉，提示甲鱼蛋粉与大蒜、维生素E、红花籽油之间可能存在联合作用，但其具体的作用模式尚不能确定。本研究的结果对于进一步研究甲鱼蛋的保健作用和合理开发天然甲鱼蛋保健产品具有重要的指导意义。
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参考文献
1 中国疾病控制中心营养与食品安全所.中国食物成分表2002.北京:北京大学医学出版社，2002.
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3 刘小立，孙秀发.甲鱼提取液抗肿瘤作用的研究.食品科学，1997，18(9):64-66.
4 郑艺青，孙秀发.甲鱼提取液延缓衰老和提高免疫功能作用的研究.食品科学，1997，18(8):41-43.
5 钱国英，朱秋华.不同生长条件对中华鳖营养成分的影响.营养学报，2001，23(2):181-183.
6 叶海英，张忠义，徐峰.大蒜免疫调节作用的研究进展.中医药学报，2003，31(3):54-56.
7 周显青，孙儒泳，牛翠娟.维生素E对免疫功能的影响.生理科学进展，2000，31(2):163-165.
8 凌学静，张海石，黄岩.西红花对小鼠免疫增强作用的研究.中国中医基础医学杂志，1998，4(12):28-29.
作者单位:1 100083北京大学公共卫生学院
2 日本乐模公司
(编辑秋 实), 百拇医药(王军波)